纪念馆含侵华日军南京大屠杀史实展、“三个必胜”主题展、“二战中的性奴隶——日军‘慰安妇’制度及其罪行展”等三个基本陈列，展示了南京大屠杀、日军“慰安妇”制度、中国人民抗日战争伟大胜利的历史。共展出近4000幅照片，9992件各类文物，262部影像资料，智慧而严肃地表达了暴行、抗争、胜利、审判、和平五大主题。其中，美国牧师约翰·马吉牧师用于拍摄南京大屠杀历史影像的摄影机和影像资料已经被联合国教科文组织列入《世界记忆名录》。
纪念馆内现存三处南京大屠杀“万人坑”遗址，分别展示了1984年、1998-1999年以及2006年发现的遇难同胞遗骸。2015年12月，“三个必胜”新展馆和分馆南京利济巷慰安所旧址陈列馆建成后，纪念馆总占地面积10.3万平方米，建筑面积5.7万平方米，展陈面积达2万平方米。分布有7处广场、23座单体雕塑和一座大型组合雕塑、8处各种形式的墙体、17座各种造型的碑体。
自1985年8月15正式建成开放以来，截止到2018年底，共接待来自100多个国家和地区的观众近亿次。先后接待了多位党和国家领导人，以及丹麦女王玛格丽特二世、美国前总统卡特、捷克总统泽曼、日本前首相村山富市、海部俊树、鸠山由纪夫、福田康夫、哥斯达黎加前总统、诺贝尔和平奖获得者——阿里亚斯，澳大利亚参议院议长玛格丽特·里德、韩国前总理姜英勋等；30多个国家的驻华大使、驻沪总领事也曾来馆参观。近年来，近百次接受来自美国、英国、加拿大、日本、西班牙等国家和香港、澳门等地区的媒体采访。
纪念馆1997年被评为全国爱国主义教育示范基地，2006年被国务院颁布为“全国重点文物保护单位”，2008年被评为全国“国家一级博物馆”，2015年被中央精神文明建设指导委员会评为全国文明单位，2018年被评为“改革开放40周年”优秀先进集体。
从2014年12月13日起，纪念馆作为南京大屠杀死难者国家公祭仪式的固定举办地。
纪念馆分展览集会区、遗址悼念区、和平公园区和馆藏交流区等4个功能性区域。
展览集会区分为史料陈列厅和集会广场。史料陈列陈列展示基本陈列和专题陈列。集会广场上有主题雕塑—冤魂呐喊、标志碑、灾难之墙、和平大钟，每年的12月13日，人们都会在这里集会，公祭遇难同胞，撞响和平大钟，发表和平宣言。
遗址悼念区包括“古城的灾难”大型组合雕塑、“历史证人的脚印”铜版路、《狂雪》诗碑墙、石壁墙与邓小平手写馆名、墓地广场、浮雕《劫难》《屠杀》《祭奠》、“母亲的呼唤”立雕、“万人坑”遗址陈列和悼念广场祭场、冥思厅等。
和平公园区以和平为主题，是世界各国人民进行和平交流的重要场所。包含胜利之墙、和平公园、汉白玉雕塑《和平》、紫金草花园、日本友人植树林等。
馆藏交流区是寓馆藏、交流、办公为一体的综合功能区域，其主要设施有学术报告厅、图书馆、特藏库等。
主要陈列的文物有当年日军屠杀现场照片，历史档案资料，中外人士当年对这次历史惨案所写的纪实、报道和出版的专著、图书、报刊，至今尚健在的1000多位幸存者的名册、证言、证词和实物；当年屠杀南京军民的日军军官和士兵的日记、供词；崇善堂、红卍字会、红十字会等慈善团体掩埋尸体的照片、统计表、臂章证词以及远东国际军事法庭和中国军事法庭对南京大屠杀主犯松井石根、谷寿夫审判的照片、判决书等。电影放映厅，有200个座位，向观众放映《侵华日军南京大屠杀》历史文献纪录片。
陈列室还有约翰·马吉的16毫米摄像机及4盘电影胶片；拉贝、京特、威尔逊等外籍证人的日记、信函、墓碑、手杖、望远镜等一批文物；日本老兵东史郎等人的日记、勋章等；日军中国战区投降典礼受降桌；李济深、张治中等11位国民党军政要员关于南京大屠杀的题词和留言；侵华日军南京司令部使用过的挂钟、保险柜、军旗；日军使用的指挥刀、机枪、手雷、炮弹、毒气弹、毒气武器箱、皮带、绑腿、军装、军毯、钢盔、啤酒瓶、饭盒、警报器等，日军焚烧遇难者尸体用的汽油桶、残害南京市民的铁钉、抢劫财物毁坏的木箱；日军当年发放的“良民证”、“支那事变纪念章”、1644细菌部队使用的手术剪刀和证章，慰安所日军题字墙、战死在紫金山的日军官兵碑；肖娴、华君武、肖平等创作的一批南京大屠杀书画作品；美国李自健创作的《南京大屠杀屠·生·佛》油画；赵勇创作的《南京大屠杀》系列组画；香港施禀谋创作的鸡血石雕刻；军旅诗人王久辛创作的《狂雪》长诗铜版墙；“留下历史证人脚印”铜版路及幸存者彭玉珍、倪翠萍铜塑、呈十字架形的“标志碑”、“倒下的300000人”抽象雕塑及铜质“和平大钟”、“古城的灾难”组合雕塑、“母亲的呼唤”花岗岩圆雕、“劫难·屠杀·祭奠”三组高浮雕、“母与子”和“埋尸队员”泥雕、“拉贝”和“马吉”半身雕像等，共500余件。
8:30—17:30，周一闭馆（国家法定节假日除外）
地铁：
2号线到云锦路站，从2号口出站由一号门进馆参观。法定节假日及大客流期间从3号口出站由一号门进馆参观。
公交：
7、37、61、63、9、19、82、41、48、39、57、204、161、166、96、113、552、23、109、D12、D4、D7等22条线路
自驾：
1、车辆从水西门大街过来，可在水西门大街与江东中路红绿灯处沿辅道右转，向前约200米，右转可进入。
2、车辆从汉中门大街过来，可在汉中门大街与江汊路路口红绿灯左转，行进约300米，右转可进入。
3、车辆从江东北路由北向南过来，可在江东北路与水西门大街红绿灯路口处调头，向前行进约200米，右转可进入。
4、车辆从江东中路由南向北过来，可在江东北路与水西门大街红绿灯路口处继续直行约200米，右转可进入。
1982年，日本文部省审订通过的历史教科书将“侵略中国”的记述改为“进入”。
1983年底，南京市人民政府经中国共产党江苏省委员会和江苏省人民政府批准，开始筹建纪念馆，设立了“南京大屠杀”编史、建馆、立碑领导小组，由当时的南京市市长张耀华任组长。
1985年8月15日，南京人民政府于建成并开放侵华日军南京大屠杀遇难同胞纪念馆，场馆的所在地是侵华日军南京大屠杀江东门集体屠杀遗址和遇难者丛葬地，故又称江东门纪念馆。
1995年，侵华日军南京大屠杀遇难同胞纪念馆开始二期工程建设。
2002年12月12日，“历史证人的脚印”铜版路建成开放。
2004年3月1日，侵华日军南京大屠杀遇难同胞纪念馆在全国率先对社会公众免费开放，当年接待观众就达114万人次。
2005年12月13日，纪念馆在原馆的基础上进行扩建，二期扩建工程正式奠基。
2007年12月13日，重新开放的纪念馆继续实行免费开放政策。
2015年5月，利济巷慰安所旧址开始修缮，完成后将做为纪念馆的分馆开放。
2015年12月1日，侵华日军南京大屠杀遇难同胞纪念馆的分馆——利济巷慰安所旧址陈列馆正式开馆，对公众开放。
2015年12月7日，侵华日军南京大屠杀遇难同胞纪念馆三期新馆正式对外开放。
2019年12月13日，侵华日军南京大屠杀遇难同胞纪念馆举行捐赠仪式。
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