1974年9月30日，出生于美国旧金山。6岁时，在看完功夫电影《少林寺》后，对武术产生了兴趣。11岁时，拜一名北京艺人为师开始习武。
1993年，在美国俄勒冈大学攻读建筑系，并获得建筑副修奖学金。
1994年，赢得California Martial Art Competitions的亚军，并在美国西岸排名第二位。同时，吴彦祖还成立了俄勒冈大学中国武术学会，并成为第一任教练，收了二十几个徒弟，一共教了五年。
1997年，毕业后的吴彦祖前往香港旅行，后在姐姐的建议下开始当模特。
1998年，被杨凡导演选中，接拍了个人首部电影作品《美少年之恋》，之后正式进入演艺圈；同年10月，被张婉婷选中出演爱情文艺片《玻璃之城》，并凭借在该片中的表现提名第18届香港电影金像奖最佳新演员。
1999年2月13日，与成龙、舒淇合作主演的爱情喜剧片《玻璃樽》上映；6月13日，主演的动作片《特警新人类》上映；同年，主演动作片《紫雨风暴》。
2000年，与林超贤导演合作，并出演了警匪动作片《重装警察》；同年11月，搭档王祖贤出演了文艺片《游园惊梦》。
2001年，首次与古天乐合作，并出演了动作片《野兽之瞳》；10月25日，出演的由张婉婷执导的青春爱情片《北京乐与路》上映。
2002年，与杨千嬅首次合作，并出演了爱情喜剧片《新扎师妹》；同年，出演了由张艾嘉执导的科幻爱情片《想飞》；6月14日，主演的惊悚动作片《变脸迷情》上映；11月15日，搭档李美琪主演的动作片《赤裸特工》上映。
2003年3月，与杨千嬅合作出演了喜剧片《新扎师妹2》；8月21日，由吴彦祖首次担任监制并主演的惊悚片《妖夜回廊》上映；11月，主演古装喜剧片《花魁杜十娘》。
2004年2月，与张柏芝合作，出演由尔冬升执导的动作剧情片《旺角黑夜》；9月24日，与成龙合作主演的犯罪动作片《新警察故事》上映，并凭借该片获得第41届台湾电影金马奖最佳男配角奖，而他也因此获得了高关注度与人气。
2005年，与梁家辉、郑秀文合作，主演了爱情片《长恨歌》；同年，首次与内地导演合作，出演由冯小刚执导的古装剧情片《夜宴》。
2006年4月20日，执导并担任编剧的个人电影处女作《四大天王》上映。
2007年2月13日，与尔冬升导演合作的犯罪剧情片《门徒》上映。
2008年，联同林建岳成立了星革盟有限公司经纪公司。
2009年4月2日，与成龙合作主演的动作片《新宿事件》上映；7月24日，与刘青云、古天乐合作主演的警匪动作片《窃听风云》上映。
2010年2月11日，与徐若瑄等众多艺人联合主演的爱情片《全城热恋》上映；3月，担任第34届香港国际电影节国际短片竞赛单元评审；4月30日，搭档袁泉主演的爱情片《如梦》上映；7月2日，与古天乐、李冰冰合作主演的动作片《枪王之王》上映。
2011年3月，与冯德伦合作创立了突围映画电影制作公司，并与华谊兄弟签订了五年合作协议；3月31日，与古天乐、高圆圆合作主演的都市爱情片《单身男女》上映；8月18日，主演的警匪动作片《窃听风云2》上映。
2012年9月27日，担任监制并出演的武侠动作片《太极2：英雄崛起》上映；11月29日，与刘烨、张震合作主演的古装历史片《王的盛宴》上映。
2013年11月22日，担任监制并主演的犯罪动作片《控制》上映；同年，搭档沙尔托·科普雷主演了科幻惊悚片《木卫二报告》。
2014年4月18日，与张家辉领衔主演的悬疑犯罪片《魔警》上映；5月29日，主演的犯罪片《窃听风云3》上映。
2015年8月13日，搭档白百何主演的励志喜剧片《滚蛋吧！肿瘤君》上映；11月15日，担任制作人并主演的功夫美剧《荒原第一季》在美国AMC电视台首播。
2016年6月8日，出演的由邓肯·琼斯执导的奇幻动作片《魔兽》在中国内地上映；11月25日，与林岭东导演合作的动作悬疑片《冲天火》上映。
2017年3月19日，主演的功夫美剧《荒原第二季》在美国AMC电视台首播，该剧平均收视率达3.6M，在美国有线平台排名第4；10月13日，首次参加的户外建筑真人秀节目《漂亮的房子》播出；10月20日，与杰拉德·巴特勒、吉姆·斯特吉斯合作主演的科幻灾难片《全球风暴》在上映。
2018年3月16日，搭档艾丽西亚·维坎德主演的动作奇幻片《古墓丽影：源起之战》在美国和中国内地同步上映；4月22日，与艾米丽·比查姆、阿拉米斯·奈特合作主演的美剧《荒原第三季》在美国AMC电视台首播。
2020年11月20日，领衔主演的动作警匪片《除暴》上映。
2021年8月20日，与休·杰克曼、丽贝卡·弗格森合作主演的科幻动作片《追忆迷局》定档于北美上映。
2022年2月，确定出演Disney+电视剧《美生中国人》。
《全球风暴》、《窃听风云》、《门徒》、《夜宴》、《枪王之王》、《旺角黑夜》、《新警察故事》、《王的盛宴》、《古墓丽影：源起之战》、《除暴》、《魔兽》、《滚蛋吧！肿瘤君》、《控制》、《木卫二报告》、《魔警》等。
《美生中国人》、《荒原第一季》、《荒原第二季》、《荒原第三季》。
《妖夜回廊》、《四大天王》、《如梦》、《太极1：从零开始》等。
1999年，提名第18届香港电影金像奖最佳新演员奖-《玻璃之城》。
2005年，提名第24届香港电影金像奖最佳男主角奖-《旺角黑夜》。
2005年，提名第24届香港电影金像奖最佳男配角-《新警察故事》。
2007年，获第26届香港电影金像奖新晋导演奖-《四大天王》。
2015年，提名第34届香港电影金像奖最佳男主角奖-《魔警》。
2003年，提名第40届台湾电影金马奖最佳男主角奖-《妖夜回廊》。
2004年，提名第41届台湾电影金马奖最佳男配角奖-《新警察故事》。
2009年，提名第46届台湾电影金马奖最佳男主角奖-《如梦》。
2005年，提名第10届香港电影金紫荆奖最佳男配角奖-《新警察故事》。
2005年，提名第10届香港电影金紫荆奖最佳男主角奖-《旺角黑夜》。
2007年，获第7届华语电影传媒大奖最佳新导演奖-《四大天王》。
2007年，提名第7届华语电影传媒大奖最佳编剧奖-《四大天王》。
吴彦祖是个很纯静很优秀的男生，他不仅人长得帅，对人也热情有礼貌。在片场工作很认真，是个很有志向的人。（导演张婉婷评）
吴彦祖外形帅气阳光、演技出挑，从小习武的他在很多动作片里都有过出色表现。不论是主角配角、正派反派或是亦正亦邪，吴彦祖都愿意尝试，能够胜任每个内心丰富的角色。吴彦祖不轻易被定型，不仅戏路更加宽广，也让观众对他一直保有一定的新鲜感。（腾讯网、钱江晚报、光明网评）
吴彦祖是一个非常安静，非常善良，非常绅士的人。而他表演时候的一举一动，我们看到他的眼神，都足以让你感受到古尔丹的力量。这是他的演技的体现。（宝拉·巴顿评）
吴彦祖工作非常认真，是一位非常杰出的演员。（凯文·史派西评）
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