1976年6月29日，马伊琍出生于上海市虹口区。15岁时，马伊琍参加上海电视台的综艺舞蹈队，正式自食其力自己赚取学费。
1993年，马伊琍被选中主演电影《刘海粟》，那是她的第一次触电经历，收获800元片酬。
1994年，马伊琍考入上海戏剧学院94级表演系本科。
1996年，在电视剧《真空爱情记录》中饰演夏文心，讲述了一群大学毕业生为了工作和爱情奋斗的故事。
1998年，毕业于上海戏剧学院，毕业后参演了第一部改编自陕西驻沪作家李春平同名小说的电影《玻璃是透明的》，马伊琍饰演“小丫子”，同年出演的第一部古装电影《孔乙己》至今没有公映。
2000年，出演了《黑洞》饰演三陪女，马伊琍的表演事业得到了更好的提升，在电视剧《前世今生》中饰演美貌且气质超凡的秦婉莹。
2001年，出演电视剧《白天睡觉的女人》饰演李秀，在电影《西施眼》中饰演施雨，该剧在2002年美国夏威夷国际电影节中获评审团大将及亚洲最佳电影。
2002年，因出演电视剧《还珠格格Ⅲ之天上人间》中夏紫薇一角而被大众所熟知。
2004年，出演了由黄磊指导的《天一生水》饰演一个混血姑娘明妮。
2005年，出演张黎导演的电视剧《锦衣卫》在剧中就出演了一个这样的倾国美人客印月。
2006年，参演《乔家大院》扮演的“江雪瑛”。
2007年，出演由赵宝刚指导的青春励志电视剧《奋斗》夏琳一角而知名度得到进一步的提升。
2008年，因拍电视剧《为谁心动》时无悔剃光了头，凭借影片《江北好人》，马伊琍战胜了李冰冰、范冰冰两位大热候选人，成为了长春电影节影后。
2009年，与佟大为共同出演了电视剧《婚姻保卫战》演出夫妻间事。同年马伊琍出演了首部反映豫商故事的电视剧《经纬天地》在CCTV-8播出，这也是她继《乔家大院》之后首次登陆央视，马伊琍扮演尚达志的妻子顺儿，这也是马伊琍生产复出首部电视剧作品。
2010年，与涂松岩领衔主演的都市题材电视剧《双城生活》反映了“双城恋”话题，让许多观众产生了不小共鸣并引发了网络热议，而马伊琍在剧中饰演北京大妞郝京妮。凭借该剧获得国剧盛典2011年度最佳女演员。
2013年，年初马伊琍与杜淳、刘莉莉、陈思斯等众多明星合作电视剧《青春期撞上更年期Ⅱ》，此外，还客串电影《不二神探》，并且彻底颠覆以往的形象。2013年，首当制片人的马伊琍与首次当导演的丈夫文章合作的电视剧《小爸爸》。
2015年，出演了公路犯罪片《未择之路》。电视剧《北上广不相信眼泪》于11月7日在北京卫视、浙江卫视播出；7月16日，参演的民国时期战争题材作品《那些女人》正式杀青。
2016年，与陈建斌领衔主演的当代都市幽默轻喜剧《中国式关系》于在北京杀青。4月，在文章执导的谍战剧《剃刀边缘》中饰演女主角。
2017年，主演都市情感剧《我的前半生》，在剧中饰演罗子君，凭借该剧获得第24届上海电视节“白玉兰奖”最佳女主角。
2018年，凭借电影《那些女人》获得第21届上海国际电影节电影频道传媒关注单元最佳女配角奖；9月14日，其主演的犯罪电影《未择之路》上映，片中饰演一名卡车司机小眉；9月30日，与姚晨共同主演的剧情片《找到你》上映。
2019年，与高伟光主演的民国探案剧《爱思小姐探案集》在横店开机，在剧中饰演了法租界警务局中央巡捕房探员苏雯丽；4月26日，凭借电影《找到你》获得第10届中国电影导演协会年度女演员奖；6月12日，凭借电影《找到你》获得第25届华鼎奖中国电影最佳女主角；6月，将担任第25届上海电视节白玉兰奖电视剧类别中国电视剧单元评委；9月22日，与刘烨合作主演的都市创业剧《在远方》播出；10月22日，凭借电影《找到你》提名第32届中国电影金鸡奖最佳女主角；11月，主演由薛晓路执导的职场现实题材剧《在不安的世界安静地活》，在剧中饰演林墨。
2020年，与高伟光主演的民国探案剧《旗袍美探》播出。
旗袍美探2020-8-28 饰演苏雯丽 导演邓科 主演高伟光、董璇、卜冠今、吴昊宸
在远方2019-09-22 饰演路晓欧 导演陈昆晖 主演刘烨、梅婷、保剑锋、曾黎
我的前半生2017-07-04 饰演罗子君 导演沈严 主演靳东、袁泉、雷佳音、吴越
剃刀边缘2017-03-20 饰演关海丹 导演文章 主演文章、丁勇岱、芦芳生、栾元晖
中国式关系2016-09-07 饰演江一楠 导演沈严 主演陈建斌、赵立新、胡可、叶一云
北上广不相信眼泪2015-11-07 饰演潘芸 导演李骏 主演朱亚文、张兆辉、张可颐、侯京健
小爸爸2013-09-02 饰演李三妹 导演文章 主演文章、王耀庆、朱佳煜、刘欢
青春期撞上更年期Ⅱ2013-03-06 饰演贺飞儿 导演庞好 主演杜淳、曹炳琨、董璇、刘莉莉
风和日丽2012-03-28 饰演杨小翼 导演杨文军 主演李晨、刘芸、尤勇、陶慧敏
双城生活2011-07-20 饰演郝京妮 导演安建 主演涂松岩、张小磊、岳红、商忆莎
青春期撞上更年期2010-12-15 饰演贺飞儿 导演庞好 主演杜淳、董璇、曹炳琨、刘莉莉
经纬天地2010-08-17 饰演梁顺儿 导演黄健中 主演贾一平、周扬、张光北、田野
婚姻保卫战2010-08-16 饰演李梅 导演赵宝刚、王迎 主演佟大为、黄磊、袁立、于娜
二哥2009-10-01 饰演苏教授女儿 导演梁天 主演洪剑涛、曹艳艳、杨明娜、马崇乐
锁春记2008-11-23 饰演庄芷言 导演黄文利、郝琳 主演于和伟、咏梅、甘婷婷、康英
美丽无声2008-10-06 饰演阿菊 导演黄健中 主演王姬、陈龙、杨昆、惠娟艳
幸福在哪里2007-09-21 饰演齐若谷 导演王雷 主演贾一平、张博、白百何、徐秀琳
永远的铭记2007-09-01 饰演沈璇青 导演刘新 主演蓝正龙、金鑫、午马、万美汐
奋斗2007-05-17 饰演夏琳 导演赵宝刚、王迎 主演佟大为、李小璐、文章、王珞丹
别说爱情苦2007-6-29 饰演俞青地 导演李路 主演孙玮、肖荣生、陈锦鸿、王钏如
锦衣卫2006-10-23 饰演郑贵妃 导演张黎 主演谭凯、文章、黄志忠、刘文治
月牙儿与阳光2006-05-20 饰演张小月 导演霍庄、徐晓星 主演伊春德、黄磊、江珊、寇振海
酒巷深深2006-04-03 饰演古雨 导演郭宝昌 主演邵兵、朱媛媛、王虎城、关大心
乔家大院2006-02-13 饰演江雪瑛 导演胡玫 主演陈建斌、蒋勤勤、倪大红、雷恪生
碧海深沉2006 饰演友情演出 导演何燕江 主演彭丹、丁军、马少骅、张世
五妹2005-09-10 饰演五妹 导演刘新 主演王新军、奚美娟、刘艺、高宝宝
天一生水2005-06-25 饰演林若云 导演黄磊、韩魏 主演黄磊、范冰冰、耿乐、李解
七武士2004-01-23 饰演梅小瑶 导演刘海波 主演邵峰、孙耀威、王艳、何赛飞
七日2003-10-01 饰演邵静然 导演管虎、王熠 主演黄磊、耿乐、池华琼、成泰燊
谁都会说我爱你2003-09-21 饰演林菊若 导演丽珍 主演李亚鹏、秦海璐、郭晓冬、陈佳妍
我和我的祖国2019-09-30 饰演小美（成年） 导演陈凯歌、徐峥 主演吴京、刘涛、徐峥、段博文
进京城2019-05-10 饰演凤格格 导演胡玫 主演富大龙、马敬涵、王子文、姚安濂
找到你2018-09-30 饰演孙芳 导演吕乐 主演姚晨、袁文康、吴昊宸、王梓尘
未择之路2018-09-14 饰演小眉 导演唐高鹏 主演王学兵、朱耕佑、王旭峰、文章
那些女人2018-09-03 饰演江家娘娘 导演江平 主演何赛飞、胡可、殷桃、周冬雨
不二神探2013-6-21 饰演警局高级长官 导演王子鸣 主演文章、李连杰、刘诗诗、陈妍希
寒战2012-11-8 饰演刘杰辉太太 导演梁乐民、陆剑青 主演郭富城、梁家辉、杨采妮、李治廷
失恋33天2011-11-8 饰演分手女孩B 导演滕华涛 主演文章、白百何、张嘉译、王耀庆
跟踪孔令学2011-4-30 饰演杨秋月 导演张骁 主演范伟、孙宁、白卉子、支一
江北好人2007-10-19 饰演赵小芸 导演刘新 主演夏雨、马军勤、苗圃、江珊
危情雪夜2004-2-20 饰演苏宝 导演陈国星 主演陶泽如、吴越、高明、何冰
西施眼2002-9-27 饰演施雨 导演管虎 主演黄依群、杨倩倩、王传君、刘巨勇
一见钟情2002 饰演橘子 导演夏钢、孟朱 主演陆毅、范冰冰、海清、雪村
聊斋·席方平2000 饰演杜玉翠 导演谢铁骊、杜民 主演沙溢、席与立、谢钢、李法曾
玻璃是透明的1999 饰演小丫子 导演夏钢 主演黄凯、许晓丹、马仑、王珏
孔乙己1999 饰演宋含玉 主演郭昊伦
2018 第21届上海国际电影节-电影频道传媒大奖最受传媒关注女配角奖 那些女人 （获奖）
2018 第21届上海国际电影节-电影频道传媒大奖最受传媒关注女主角奖 进京城 （提名）
2019 第32届中国电影金鸡奖最佳女主角奖 找到你 （提名）
2019 第11届澳门国际电影节最佳女主角奖 未择之路 （提名）
2018 第10届澳门国际电影节最佳女主角奖 进京城 （提名）
2008 第9届中国长春电影节-金鹿奖最佳女主角奖 江北好人 （获奖）
2019 第10届中国电影导演协会年度女演员奖 找到你 （获奖）
2020 第26届上海电视节-白玉兰奖最佳女主角奖 在远方 （提名）
2018 第24届上海电视节-白玉兰奖最佳女主角奖 我的前半生 （获奖）
2017 第23届上海电视节-白玉兰奖最佳女主角奖 中国式关系 （提名）
2006 第23届中国电视金鹰奖观众喜爱的女演员奖 乔家大院 （提名）
2011 第1届亚洲彩虹奖最佳女喜剧演员奖 婚姻保卫战 （获奖）
2008 第15届北京大学生电影节最佳女主角奖 江北好人 （提名）
2019 第17届中国电影表演艺术学会金凤凰奖学会奖 （获奖）
2009 第12届中国电影表演艺术学会金凤凰奖学会奖 江北好人 （获奖）
2019-06 第25届华鼎奖中国电影最佳女主角 找到你 （获奖）
2018-09 第75届威尼斯国际电影节-“聚焦中国”单元焦点女演员奖 未择之路 （获奖）
2011-11 第3届英国万像国际华语电影节最佳女配角奖 跟踪孔令学 （获奖）
2009-03 第2届华鼎奖中国年度影视表现最佳女演员奖 江北好人 （获奖）
2017-10 第4届横店影视文荣奖最佳女主角 我的前半生 （获奖）
2016-05 第19届华鼎奖中国百强电视剧最佳女主角 北上广不相信眼泪 （获奖）
2019 新时代国际电视节建国70周年全国十佳电视剧女演员 （提名）
2018 2017国剧盛典年度实力剧星 （获奖）
2013 “CCTV 2012中国电视剧年度明星盛典”特别突破奖女演员奖 （获奖）
2012 “CCTV 2012中国电视剧年度明星盛典”特别突破奖女演员奖 （获奖）
2011 爱奇艺2012年度盛典“年度最佳电视剧女演员” （获奖）
2011 优酷影视指数盛典“开年优酷指数最佳女演员奖” （获奖）
2011 “国剧盛典”年度最佳女主角 双城生活 （获奖）
2011 “大剧盛典”获得“开年网络指数最佳女演员奖” （获奖）
2010 《申江服务导报》-永华电影盛宴“年度影视剧红人女演员” （获奖）
2010 《北京青年周刊》BQ红人榜“年度人气女演员奖” （获奖）
2010 腾讯星光大典获“年度电视女演员” （获奖）
2009 2008风尚权利榜“最受欢迎女演员奖” （获奖）
2012 “优品中国文化行”大使 （获奖）
2012 “星尚大典”星尚演绎先锋人物 （获奖）
2011 “2011中国最美50人盛典”获得“温暖之美”大奖 （获奖）
2011 “中国影响2010·时尚盛典”最美‧年度“荧屏情侣”(马伊琍、佟大为) （获奖）
2010 南方时尚盛典“最受公众关注 中国时尚明星” （获奖）
2009 “中国国际年度绿色风云人物”奖 （获奖）
2008 大爱时尚盛典“精品大爱之星奖” （获奖）
2007 CCTV少儿频道欢乐盛典“最具奋斗精神奖” （获奖）
2007 第四届“COSMO BEAUTY AWARDS”获“年度最佳造型奖” （获奖）
2007 《北京青年周刊》BQ红人榜“艺术红人奖” （获奖）
2006 腾讯网“娱乐中国·2006星光大典”最受欢迎四大花旦(与黄奕、李小冉、刘烨) （获奖）
我这个人婚前很擅长主外，婚后就开始慢慢学会主内，现在我是内外兼修的婚姻选手。我结婚前比较“大女人”一些，但与文章婚后，学会了在外“大女人”，在家“小女人”。（自评）
这个角色让马伊琍充分展示了极宽的戏路。（赵宝刚评）
她是好演员的代表。（朱亚文评）
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