高攀龙，字存之，号景逸，江苏无锡人。祖父高静成曾任浙江黄岩县令，父亲高继成生有五个子女，高攀龙排行第二，后因高静成的弟弟高静逸无子而被过继为嗣。
高攀龙自幼好读书懂礼仪。万历十四年（1586年），无锡知县李元冲聘请江右学派罗懋忠和顾宪成前来讲学，高攀龙受其影响，开始潜心研究“程朱理学”，确定了治学方向。
万历十七年（1589年），高攀龙中进士。不久后高静逸去世，高攀龙归家为嗣父守孝三年。
初入官场
万历二十年（1592年），高攀龙服丧期满，被朝廷任命为行人司行人，执掌传圣旨、行册封等礼仪性的事务。因平时工作比较清闲，高攀龙大量阅读行人司中丰富藏书，深入钻研二程和朱子著作，亲手抄录山西大儒薛文清的《读书录》，赞赏其“一字不可轻与人，一言不可轻许人，一笑不可轻假人”的处世态度。高攀龙还编写了《日省编》，将先朝大儒的语录附在《大学》章句之下，作为初学者的指南。又将有关儒、释差异的言论汇集成《崇正编》，以抵制王阳明“心学”所提倡的儒、释、道三教合一的主张。
当时四川佥事张世则呈上自己著述的《大学初义》，诋毁程朱之学，并请求颁行天下。高攀龙极力反对，上疏驳其荒谬。这本书因而未能刊行。
这一时期，明神宗已长期不理政务，朝中党派纷争、宦官横行，致使政务混乱，国力日衰。高攀龙随即上《今日第一要务疏》，称欲改变皇朝岌岌可危的形势，首先必须正本，其次要“除刑戮”、“举朝讲”、“用谏臣”、“发内帑”，革新政治。但奏疏被皇帝留中不发。
万历二十二年（1594年），侍郎赵用贤、都御史李世达等人被罢官，朝中议论多归咎首辅王锡爵。高攀龙和御史袁可立上疏，指责王锡爵排斥异己，认为皇帝不应无故贬斥大臣，并斥责郑材和杨应宿谗言诬陷，应予罢免。杨应宿则上疏弹劾高攀龙，言辞狂妄近乎荒诞。部院提请轻罚二人，神宗下旨贬高攀龙为广东揭阳典史。
高攀龙自水路前往揭阳就任，在船上就订立严规，要求自己静心以涵养德性，不被外界干扰。到揭阳后，每日在官衙教授学徒，培养了不少学生。还四处察访民情吏弊，惩治地方恶霸。高攀龙在揭阳停留的半年内结识了陆粹明及其老师萧自麓等人，对其学术思想影响深远。
万历二十三年（1595年）二月，高攀龙在赴任七个月后以事假归家，不久遭遇亲人病故，于是不再出仕。此后在家乡讲学二十余年，虽有言官多次推荐，但皇帝并不理会。
高攀龙在漆湖之畔（今蠡湖东岸）建造一座“水居”，取名“可楼”，作为自己读书静坐的场所。除刻苦钻研外，高攀龙还参与讲学，很快成为一代儒学宗师。当时高攀龙与顾宪成志同道合，交谊颇深。万历三十二年（1604年），在常州知府和无锡知县的支持下，高攀龙与顾宪成等人发起重建了东林书院，并每年举行“东林大会”。初由顾宪成主持，万历四十年（1612年）顾宪成去世后改由高攀龙主持，直至天启五年（1625年）书院被拆毁为止。当时朝野内外的士大夫无论认不认识他们本人，提起高、顾都是一致称赞。
高攀龙在讲学过程中以自己的政治理想和人格标准来评议朝政，裁量人物。当时许多与他们志趣相近的在野士大夫闻风响附，纷至沓来。在朝的李三才、赵南星、邹元标、杨涟等正直官员也与他们互通声气，遥相应和。东林书院实际上已成为社会舆论的中心。反对派对此十分忌恨，诬之为“东林党”，污蔑他们是假借讲学以结党营私。
万历四十八年（1620年）七月，神宗去世，皇太子朱常洛即位，是为明光宗。明光宗在位一月驾崩，长子朱由校即位，是为熹宗。
熹宗即位后，东林党人因拥戴有功而重新崛起。高攀龙被任命为光禄寺丞，天启元年（1621年）又进封为光禄少卿。天启二年（1622年）正月，关外重镇广宁（今辽宁北镇）失陷，明军被迫退缩到山海关一线。消息传来，朝野震惊，人心惶惶。高攀龙接连上书要求革新政治，以挽救国家濒危的命运。他在《破格用人疏》中提出要破格用人，加强战守之备，并推荐礼部右侍郎孙承宗担任防御大臣，负责处理战事。他的意见得到皇帝首肯。孙承宗也不负众望，收复了广宁和辽河以西的土地，边境平静了四年之久。
天启二年（1622年）四月，高攀龙上疏追论三案（梃击案、红丸案、移宫案），要求惩治郑养性、李如桢、崔文升等人。奏疏上达，皇帝不悦而责备高攀龙多言，但最终仍将郑养性谴归原籍。
当时孙慎行以红丸案指责前任首辅方从哲，高攀龙也引《春秋》典故归罪方从哲。给事中王志道为方从哲辩解，被高攀龙上疏严厉斥责。不久高攀龙被调任太常少卿，又上一道《恭陈圣明务学之要疏》，向熹宗阐明读书的重要性。方从哲一派故意摘出疏中指责帝王不孝的言辞激怒熹宗，熹宗欲严惩高攀龙。叶向高极力挽救，才得以罚俸一年而作罢。
天启二年（1622年）九月，高攀龙调任大理寺右少卿。十一月，升任太仆卿、刑部右侍郎。
天启四年（1624年）八月，高攀龙升任都察院左都御史，上《纠劾贪污御史疏》弹劾御史崔呈秀。疏中揭露崔呈秀在巡按淮扬地区时贪赃枉法、铺张浪费。吏部尚书赵南星经复查认为事实确凿，提请将崔呈秀戍边。崔呈秀得知后连夜投奔魏忠贤，认魏忠贤为义父。
此时以魏忠贤为首的阉党势力日益扩张，控制了朝廷内外。东林党人如杨涟等纷纷上书参劾魏忠贤，双方争斗进入白热化阶段。
此时魏忠贤正借机大肆迫害东林党人，称高攀龙与赵南星结党营私，皇帝下旨严厉斥责。不久后南京御史游凤翔出任知府，攻击高攀龙徇私、排挤同僚，高攀龙因而被罢黜。
高攀龙等人被罢官后，以魏忠贤为首的阉党控制了朝廷大权，编派了《缙绅便览》《点将录》《天鉴录》《同志录》等黑名单，将不依附于自己的官员开列在内，予以打击。天启五年（1625年）八月，魏忠贤矫旨，以东林书院为始将全国书院尽数拆毁。
天启六年（1626年）二月，崔呈秀不甘心高攀龙仅被罢官，必欲除之。于是假造浙江税监李实的奏本，诬告高攀龙、周起元等七人贪污，派遣缇骑前来抓捕。三月，高攀龙整冠束带前去拜谒先贤杨时的祠堂。回家后与弟弟高士鹤及门生赏花于后花园池畔，谈笑自如。此时有人前来禀告周顺昌已被逮捕，高攀龙闻言神情泰然，笑说：“我本视死如归”。归家后与夫人谈笑如常，没有异样。亲笔书信交给两个孙子，交代翌日递给校官，而后闭门遣散诸孙。不多时高攀龙的儿子们（发觉异样）前来探查，发觉高攀龙已自沉于池塘，时年六十四（虚岁六十五）。
子孙们打开高攀龙的信，乃是遗嘱，上面写着：“我虽被罢免官职，但过去曾是朝廷大臣。大臣不可以被侮辱，因为大臣被辱等同于国家受辱。我现在只有恭敬地面北叩首，以效仿屈原的遗愿。皇帝的恩泽未能报答，只愿来世再报。臣高攀龙绝笔。希望使者带去这封信向皇上复命。”
高攀龙就死前曾致书同年袁可立道：“弟腐儒一，无以报国，近风波生於讲会，邹冯二老行，弟亦从此去矣”（《高子文集·答袁节寰中丞》）。其言犹未尽之厚望可见于笔端，从此袁可立这位力图远离党争的正直大臣走上了对抗阉党的前台，每议事与阉党“数有所抵牾，欲自请外”（黄道周《节寰袁公传》）。天启六年（1626年）十一月，袁可立抗疏道：“此非挂冠神武门时呼？”（《睢州志·袁可立传》）。后来九卿公推袁可立南京户部尚书，再改兵部尚书参赞机务，魏忠贤从中作梗以自己的心腹刘廷元代替袁可立掌南兵部，时北则崔呈秀为本兵，天下兵马大权二人一手握定。自袁可立“归而魏焰益肆”，忠贤推戴之势成矣。黄道周说：“当魏崔时，盖无复然明义、真者，有之，则必自大司马节寰袁公也。”（《节寰袁公传》）
崇祯初年（1628年），朝廷为高攀龙平反昭雪，赠太子太保、兵部尚书，谥“忠宪”。
高攀龙的诗文被称为“立朝大节，不愧古人，发为文章，亦不事词藻而品格自高”。著有《高子遗书》12卷，以及《周易易简说》《春秋孔义》《正蒙释》《二程节录》《水居诗稿》《毛诗集注》等书。
高攀龙是东林学派的精神领袖之一，与顾宪成兄弟创建了东林书院。他在学术思想上的最大贡献，在于提倡“治国平天下”的“有用之学”，反对王学（王守仁学派）末流的“空虚玄妙”之学。他认为“无用便是落空学问”，“立本正要致用”，把“治国平天下”看做是格物致知和个人道德修养的必然结果。“修身、齐家、治国、平天下”是他毕生追求的政治理想，因此后人评价他“居与游无出乎家国天下”。
无论在朝在野，高攀龙时刻关注国家的命运，关心百心的生活。在邪恶面前捍卫了自己的政治理想，保持了崇高的气节。他的思想与道德足以成为后世楷模。
高攀龙担任行人职位时大量阅读经典，但仍自感“读书虽多，心得却少”，于是改用半日读书、半日静坐的方法涵养德性，此后几十年从未间断。
高攀龙的静坐功夫造诣甚高。所谓静坐以“平常”为要诀，“平常”即清静自然：“以其清静不容一物，故谓之平常”，“静中妄念即净，昏气自清，只体认本性、原来本色，还他湛然而已”，“湛然动去，静时与动时一色，动时与静时一色，所以一色者，只是一个平常也。故曰无动无静，学者不过借静坐中认此无动无静之体云尔”。高攀龙在著作《书静坐说后》中又把理学的“主一”观念引入静坐论，认为“必收敛身心，以主于一，一即平常之体也，主则有意存焉，如意非著意，盖心中无事之谓一，著意则非一也。”可见高攀龙的静坐说也并非一味讲静，具有“以静为主，动静交养”的含意。
董必武：“东林讲学继龟山，高顾声名旧史传。景仰昔贤风节著，瞻楹履阈学弥坚。”（诗中“高顾“指高攀龙和顾宪成）
邓拓：“东林讲学继龟山，事事关心天地间。莫谓书生空议论，头颅抛处血斑斑。”高攀龙等人是“东林一代好男儿”。
周炽成：高攀龙的身本论、天下一身论、身心论等继承和发挥了孟子、张载、程颢、朱熹、王阳明等人关于身心的思想，在儒学史上占有重要的地位。
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